繪制生長曲線的細胞培養(yǎng)實驗
細胞受殺傷性藥物作用以后，可能出現(xiàn)多方面反應(yīng)，細胞的形態(tài)和增殖生長的變化是晟易于顯現(xiàn)的。檢測藥物對細胞增殖的影響情況可用于測試藥物效應(yīng)的研究。本節(jié)介紹的藥物對細胞增殖影響的實驗主要包括繪制生長曲線的細胞培養(yǎng)實驗、成集落的細胞培養(yǎng)實驗、有絲分裂指數(shù)測定的細胞培養(yǎng)實驗、縮時電影顯微攝像術(shù)的細胞培養(yǎng)實驗。
一、繪制生長曲線的細胞培養(yǎng)實驗
(一)試驗原理
繪制培養(yǎng)細胞的生長曲線可計數(shù)細胞增長的數(shù)值，從而直觀地了解細胞生長與死亡的動態(tài)變化。常用于檢測藥物、培養(yǎng)液的成分和血清等對細胞生長的影響。
(二)材料
1．待檢材料(藥物)。
2．細胞培養(yǎng)成層的貼壁細胞。
3．試劑 0．25％溶液、O．02％EDTA溶液、培養(yǎng)基(RPMll640或DMEM)、小牛血清、Hanks液。
4．器材25ml培養(yǎng)瓶、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、微量加樣器、血細胞計數(shù)板、對數(shù)坐標(biāo)紙。
(三)買驗方法
1.配制EDTA細胞分離液(消化液)，將0．25％溶液與等量目0．02%EDTA溶液混合而成。
2．將單層培養(yǎng)的細胞用細胞消化液進行消化，使之成為lml的細胞懸液。
3.待檢藥物處理細胞將待檢藥物稀釋至合適作用濃度，向細胞懸液中加人一定量稍檢藥物作用8 h以上。
4.用Hanks液稀釋成10ml，取少量置血細胞計數(shù)板內(nèi)計數(shù)。將細胞懸液調(diào)節(jié)成(1～3)×105／ml，分別接種于25ml培養(yǎng)瓶中(根據(jù)實驗需要決定接種瓶數(shù)及每瓶接種的數(shù)量)。
5．每天每組取3瓶計數(shù)，計算均值，連續(xù)計數(shù)7d。
(四)結(jié)果與分析
用對數(shù)坐標(biāo)紙，以細胞濃度為縱坐標(biāo)，天數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制生長曲線。
(五)注意事項
1.用懸浮培養(yǎng)細胞進行此項實驗，除不用消化外，其余操作步驟均相同。但需離心收集細胞，再用Hanks液吹打成細胞懸液，然后計數(shù)。
2.在計數(shù)細胞期問，一般不更換培養(yǎng)液。若必須更換，實驗組與對照組均同樣更換。
3．每天細胞計數(shù)均應(yīng)在相同時間進行，以便減少實驗誤差。
4.由于計數(shù)的誤差和細胞在操作過程中丟失或死亡等因素的影響，應(yīng)利用進入生長狀態(tài)的細胞進行實驗。除了進行此項實驗外，一般應(yīng)再做分裂指數(shù)測定、成集落實驗等，互相參考。
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